Kationische Formulierung von doppelsträngiger RNA als biobasiertes Pflanzenschutzmittel

Aufgrund der zunehmenden Beschränkung von chemischen Pestiziden wächst zukünftig der Bedarf an alternativen umweltfreundlichen Wirkstoffen für den Pflanzenschutz. Der gezielte Einsatz doppelsträngiger RNA (dsRNA) gegen verschiedene Schädlinge ist eine vielversprechende Alternative. So kann dsRNA im Schadorganismus, auf den sie abgestimmt ist, die RNA Interferenz (RNAi) auslösen, d.h. es werden mittels eines evolutionär stark präservierten Teils der zellulären Maschinerie zielspezifische Gene z.B. von Viren, Pilzen und Insekten ausgeschaltet (Rank & Koch, 2021). Nichtzielorganimen werden nicht geschädigt. Jedoch bestehen noch Anwendungshürden für die dsRNA im Agrarbereich. So muss die dsRNA nach der Sprühapplikation zuerst verschiedene pflanzliche Barrieren wie die wachsige Cuticula, die Zellwand und die anionische Zellmembran überwinden, damit sie in den pflanzlichen Zellen die RNAi auslösen kann (Wang et al., 2016). Dies ist besonders vor dem Hintergrund problematisch, dass Blätter Größen- und Ladungsausschlusskriterien besitzen, die die negative geladene RNA ohne eine passende Formulierung nur unzureichend überwinden kann. Zusätzlich bedrohen biotische und abiotische Faktoren wie UV –Licht und Wärme die Funktionalität der RNA. Daher ist es das Ziel unserer Forschung eine Formulierung im Submikromaßstab zu entwickeln, die neben dem Schutz vor biotischen und abiotischen Schäden auch die Pflanzenbarrieren sicher überwinden kann. Zudem soll die biologische Abbaubarkeit im Boden gewährleistet sein. Für die Formulierung wurden verschiedene Biopolymere hinsichtlich Eigenschaften wie Länge, Ladungsverteilung und –stärke, und Linearität ausgewählt und eine Methode entwickelt, in der kationische Nanopartikel durch die elektrostatische Interaktion der Biopolymere und der dsRNA entstehen. So mussten neben den geeigneten Komponenten unter anderem die passenden Ladungsverhältnisse, Konzentrationen und Mischmethoden ermittelt werden. Mit dem Ziel den Größenausschluss des Blattes zu überwinden haben wir mit dieser methodischen Vorgehensweise eine dsRNA Nanoformulierung mit einem hydrodynamischen Durchmesser von 76,4 ± 4,9 nm entwickelt. Der Nachweis der Größe erfolgte mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS) und und REM-EDX. Letztere Messungen zeigten das sphärische Partikel gebildet werden konnten. Zudem konnte die RNA in der Formulierung durch den Nachweis von Phosphat belegt werden. Das Zetapotential, welche mittels Elektrophoretischer Lichtstreuung ermittelt wurde, konnte durch den Einsatz kationischer Polymere auf +30 mV erhöht werden. Um die Beständigkeit gegenüber externem Stress zu analysieren, wurden freie und formulierte dsRNA verschiedenen biotischen und abiotischen Stresssituationen, u.a. Enzymen, Hitze und UV-Licht, ausgesetzt und die Integrität der dsRNA anschließend mittels Gel-Elektrophorese und RT-qPCR untersucht. Hierzu werden erste Ergebnisse werden gezeigt. Ein weiterer Aspekt, der für eine erfolgreiche Anwendung von dsRNA geklärt werden muss, ist die Lagerfähigkeit von dsRNA. So wird dsRNA unter unsterilen Bedingungen schnell abgebaut und sie wird gewöhnlich bei Temperaturen unter -20°C gelagert. Deswegen wurden die dsRNA Formulierungen über mehrere Wochen bei Raumtemperatur und 4°C gelagert und die Stabilität mittels DLS überprüft. In zukünftigen Versuchsreihen werden Additive eingesetzt werden, um die Sprühapplikation hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigenschaften wie z.B. der Benetzungsfähigkeit des Blattes zu verbessern. Literatur Rank, A.P., A. Koch, 2021: Lab-to-Field Transition of RNA Spray Applications - How Far Are We? Frontiers in Plant Science 12, DOI: ARTN 755203 10.3389/fpls.2021.755203. Wang, P., E. Lombi, F.J. Zhao, P.M. Kopittke, 2016: Nanotechnology: A New Opportunity in Plant Sciences. Trends in Plant Science 21 (8), 699-712, DOI: 10.1016/j.tplants.2016.04.005.